Tetrodotoxine (TTX) is een sterk neurotoxine. De naam is afgeleid van de vissenorde die het vergif bij zich draagt, namelijk de Tetraodontiformes. Over het algemeen bevindt het TTX zich in de kogelvis en de blauwgeringde octopus in verschillende organen. Voorbeelden zijn de huid, de lever en speekselklieren. De vrouwelijke kogelvis is giftiger dan de mannelijke. Dit komt doordat een deel van het TTX zich bevindt in de ovaria. De hoeveelheid TTX in een kogelvis hangt ook van het seizoen af. In het voortplantingsseizoen is de TTX-concentratie het hoogst.Clark RF, Williams SR, Nordt SP, Manoguerra AS (1999). "A review of selected seafood poisonings". Undersea Hyperbaric Med 26 (3): 175-185.
Men dacht altijd dat TTX endogeen was, dus dat dieren het zelf produceren. Er zijn binnen een bepaalde soort veel verschillen in toxiciteit, die niet genetisch verklaarbaar zijn. Uit experimenten bleek dat diverse bacteriën in staat zijn TTX te produceren. Enkele voorbeelden van deze bacteriën zijn Pseudomonas-soorten, Yotsu, M. et al, 1987. Production of tetrodotoxin and its derivatives by Pseudomonas sp. isolated from the skin of a pufferfish Toxicon 25 (2) 225 – 228 Photobacterium phosphoreum en Staphylococcus-soorten. Ook zijn er twee verschillende mogelijkheden beschreven voor het ontstaan van TTX in dieren. Bij de eerste route wordt het gif door bepaalde bacteriën gemaakt in sediment en wordt het doorgegeven in de voedselketen, met als gevolg dat het gif zich ophoopt in organismen hoger in de voedselketen. De tweede route die beschreven is zegt dat het gif een product is van een symbiose of een parasitaire vorm van micro-organisme die zich in hogere organismen bevinden.
TTX werkt op de natriumkanalen van de zenuwen en blokkeert daar de doorstroom van zenuwsignalen. TTX is zeer giftig, een dosis van 24 milligram is al voldoende om een mens te doden.Material Safety Data Sheet Tetrodotoxin. Sigma-Aldrich Version 1.4 updated 10 Feb 2005
In de Oosterschelde en de Nederlandse kustwateren is in 2015 een (voor Nederland) nieuwe soort snoerworm ontdekt die tetrodotoxine bevat. In 2016 is ook in mosselen uit de Oosterschelde tetrodotoxine aangetroffen in concentraties die boven de grenswaarde van 20 µg/kg uitkomen. Eerder was dit ook al in Britse mosselen en oesters het geval. Het is onduidelijk wat de bron van het gif is.
Geschiedenis Het is reeds lang bekend dat de kogelvis erg giftig is. De Egyptenaren hadden ca. 2700 jaar voor Christus al wetten die mensen verboden vissen te eten die geen vinnen en schubben hadden, of schelpdieren, waarschijnlijk ter bescherming tegen TTX. Dit hebben wetenschappers geconcludeerd omdat de zeedieren die TTX bevatten en daar in de buurt hebben geleefd, geen vinnen en schubben hadden of schelpdieren waren. Op 7 september 1774 noteerde James Cook in zijn logboek dat hij en zijn zeelieden zich zwak voelden en last hadden van gevoelloosheid na het eten van de lever van een kogelvis. Ze hadden de resten van de vis (voornamelijk de huid) aan dieren aan boord gevoerd. Deze vonden wel de dood, waarschijnlijk omdat ze een relatief hogere dosis binnen kregen.
Rond 1911 werd bekend dat TTX de giftige stof was in fugu. De actieve stof is gevonden in de ovaria van de fugu. Ongeveer veertig jaar later (1950) werd de stof voor het eerst uit deze ovaria geïsoleerd. In 1963 werd tarichatoxine in Californische watersalamanders vergeleken met TTX door Mitsuru Takata van de universiteit van Osaka.John W. Moore and Toshio Narahashi, Tetrodotoxin’s highly selective blockage of an ionic channel1, Department of Pfysiology and Pharmacology, Duke University, Durflam, North Carolina Hieruit bleek dat het om hetzelfde molecuul ging en dat TTX dus niet alleen in bepaalde vissen zat, maar ook in watersalamanders. Noguchi, T. and O. Arakawa, 28 may 2008. Tetrodotoxin – distribution and accumulation in aquatic organisms, and cases of human intoxication. Marine drugs (6) 220 – 242 Een paar jaar later werd ontdekt dat ook kikkers en de blauwgeringde octopussen dit gif kunnen bevatten. In 1970 werd namelijk verklaard dat in de meeste pijlgifkikkers het hoofdgif TTX was, en dat het gif dat de blauwgeringde octopus produceert met zijn speekselklieren, maculotoxine, ook gelijk is aan TTX. Nog later werd TTX ook gevonden in bepaalde weekdieren, sommige krabsoorten en enkele zeesterren. Tot slot is in 1978 de kristallijne vorm van TTX geïsoleerd.
Omdat in Japan kogelvis vaak gebruikt wordt voor fugu, zijn hier sinds 1958 strenge wetten aan verbonden. Koks moeten een driejarige opleiding doorlopen en worden daarna nog steeds streng gecontroleerd. Het kleinste foutje tijdens een dergelijke opleiding kan genoeg zijn om een student geen diploma uit te reiken. Slechts 30% van de opgeleide mensen krijgt een diploma om fugu in de horeca te mogen bereiden. Daardoor zijn er sinds die tijd nog nauwelijks ongelukken gebeurd in de horeca. Er zijn nog wel 50 tot 100 gevallen per jaar bekend met een dodelijke afloop. Deze ongelukken gebeuren over het algemeen thuis, bij mensen die het gerecht willen bereiden, maar hier niet goed in slagen.Ministerie van eten en drinken: Fugu, de kogelvis. E. Bouckaert.
Structuur Tetrodotoxine bevat een guanidiniumgroep. De structuur wordt gestabiliseerd door het verdelen van de lading over drie resonantiestructuren. Deze groep is waarschijnlijk belangrijk voor de affiniteit voor natriumkanalen, zie werkingsmechanisme. Tevens is er een pyrimidine-ring in de structuur van TTX te herkennen en een aantal gefuseerde ringsystemen met hydroxylgroepen, belangrijk voor het stabiliseren van de binding aan de Na+-receptor.
Synthese Synthese in vitro In 1972 is tetrodotoxine voor het eerst in vitro gesynthetiseerd. Deze racemische synthese is een 15 staps proces, genaamd de Kishi-Goto pathway. Kishi, Y. et al. J. Am. Chem. Soc. 1972, 94, 9217-9219 Meer recent zijn er ook syntheses ontworpen die een enantiomeer-zuiver product opleveren.Isobe, M. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 4782. DOI: 10.1002/anie.200460293).
Biosynthese De natuurlijke synthese van tetrodotoxine, zoals deze in levende organismen plaatsvindt, is nog niet volledig opgehelderd. Er is een redelijk brede steun voor de hypothese dat micro-organismen verantwoordelijk zijn voor de productie van TTX.Kotaki, Y. and Shimizu, Y. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 3 Shimizu, Y. and Kobayashi, M. Chem. Pharm. Bull. 1983, 31, 10, 3625-3631 Noguchi, T. et al. Marine Biology, 1987, 94, 625-630 Mosher and Fuhrman1, Seafood Toxins, Chapter 28, pp 333–344, ACS Symposium Series, 1984, Vol. 262, , Chapter DOI: 10.1021/bk-1984-0262.ch028 Tot deze micro-organismen behoren de Vibrio-bacteriën, in het bijzonder de V. alginolyticus, maar ook de Pseudomonas sp. Yasumoto, T. et al. Agric. Biol. Chem. 1986, 50, 793-795 Deze micro-organismen leven in symbiose met een verscheidenheid aan dieren, die hierdoor TTX bevatten. Aanwijzingen voor het bestaan van deze symbiose zijn o.a.: Kogelvissen die in gevangenschap worden grootgebracht, bevatten geen tetrodotoxine, totdat ze weefsel van een TTX-producerende vis worden gevoerd J. Johnson, Florida State University De blauwgeringde octopus uit Australië, die TTX verzamelt in zijn speekselklieren, is een gastheer van TTX-producerende bacteriën Kogelvissen bevatten V. alginolyticus bacteriën in hun darmen, die daar TTX aanmaken
Er zijn verschillende studies gedaan naar de grondstoffen voor de productie van tetrodotoxine, maar tot een definitieve, algemeen geaccepteerde uitkomst heeft dit nog niet geleid. In het artikel van Kotaki et al. wordt de hypothese geponeerd dat TTX gevormd wordt uit arginine en isopentenyl-PP. Dit wordt geconcludeerd uit de vondst van een TTX-derivaat dat twee zuurstofatomen in het koolstofskelet mist, wat duidt op een stapsgewijze oxidatie van een alicyclische verbinding, zoals al eerder voorgesteld is door Yasumoto et al. Yasumoto, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 2344-2345 Er is ook nog een andere hypothese waarbij arginine en apiose-type C5 suiker de grondstoffen zijn. Shimizu, Y. Marine Natural Products Chemistry, Kagaku Special Issue. 11 I ; Kitagawa, I., Ed.; Kagaku Dozin: Kyoto, Japan, 1987; pp 13-20. Dit wordt door Kotaki et al. verworpen, op basis van de vondst van het gedeoxideerde TTX-derivaat. Aangezien TTX door zeer uiteenlopende bacteriën geproduceerd wordt, gaat men er in ieder geval van uit dat TTX opgebouwd kan worden uit veelvoorkomende precursors.
Werkingsmechanisme De toxische werking van TTX ligt in het feit dat deze stof met hoge affiniteit bindt aan spannings-afhankelijke natriumkanalen in spier- en zenuwcellen. De meeste onderzoekers gaan ervan uit dat TTX de kanalen fysiek blokkeert. TTX is dodelijk zodra hierdoor de ademhalingsspieren van het middenrif verlamd raken. Het werkt dus niet direct op de hartspier. Lipkind et al. A Structural Model of the Tetrodotoxin and Saxitoxin Binding Site of the Na+ - channel. Biophysical journal 1993
TTX blokkeert natriumkanalen van spier- en zenuwcellen. Er treedt een reversibele een-op-een-interactie op tussen TTX en de buitenkant van het ionkanaal. Waarschijnlijk vormt de relatief kleine guanidiniumgroep een complex en komt de rest van het molecuul als een kurk vast te zitten in het kanaal. Dit is aannemelijk, omdat losse guanidinium ionen normaal gesproken vrij door natriumkanalen heen kunnen diffunderen. TTX bindt aan zes zuurstofatomen van de selectiviteitsfilter van het kanaal. Het vormt zo vijf waterstofbruggen en een interactie tussen de positieve lading van TTX en een negatief geladen carboxyl groep van het kanaal. Hille B The receptor for tetrodotoxin and saxitoxin: a structural hypothesis. Biophysical Journal vol.15. 1975
Tetrodotoxine wordt veel gebruikt in studies naar de werking en selectiviteit van natriumkanalen. Natriumkanalen spelen een essentiële rol in de signaaltransductie tussen zenuwcellen. Eén molecuul tetrodotoxine werkt op één natriumkanaal. Het blokkeert het ontstaan van een actiepotentiaal, maar heeft geen effect op de rustpotentiaal.
Toxiciteit Tetrodotoxin is een van de meest giftige stoffen die men kent en is extreem gevaarlijk bij inname, inhalatie of opname via de huid. Aanraking met de ogen of huid kan irritatie veroorzaken.Material Safety Data Sheet Tetrodotoxin ACC# 01139 Acute toxiciteit is bij dieren getest om zo de acute toxische dosis, de LD50, te bepalen.
Toedieningswijze Acute toxische dosis Orale Inname LD50Muis334 (μg/kg) Inhalatie LD50Mens2 (μg/kg)Patockaa J, Stredab L. Brief review of natural nonprotein neurotoxins. ASA 02-1, Issue No. 88, Feb 29, 2002. Intraperitoneaal LD50Muis8 (μg/kg)Kikker14 (μg/kg) Intraveneus LD50Muis7,3 (μg/kg) Subcutaan LD50Muis8 (μg/kg) Intracerebraal LD50Muis0,6 (μg/kg)
De acute toxiciteit is niet bij mensen getest. Ervan uitgaande dat de toxiciteit bij mensen gelijk is zou een orale inname van 24 milligram of 0,5 milligram intraveneus al voldoende zijn om een persoon van 70 kg te doden. Bij inhalatie is slechts 0,15 milligram al voldoende. De mortaliteit van TTX is moeilijk te bepalen, maar bedraagt tot ongeveer 50%, zelfs met moderne ondersteunende zorg.Theodore I Benzer, MD, PhD (2009). “Toxicity, Tetrodotoxin”.
Voor zover bekend is er geen verschil in toxiciteit bij verschillende rassen. Intoxicatie komt meer voor bij Japanse mensen door hun eetgewoonten.
Intoxicatie en symptomen Intoxicatie met tetrodotoxine kan een zeer onaangename dood tot gevolg hebben. Symptomen ontwikkelen zich doorgaans binnen 15 tot 30 minuten tot enkele uren, waarbij het zelfs tot 20 uur kan duren voordat de eerste effecten zich voordoen. Een enkel geval is waargenomen waarbij de intoxicatie al na 17 minuten de dood tot gevolg had. De patiënt sterft meestal door totale verlamming van de ademhalingsspieren. Welke symptomen voorkomen en de duur van deze symptomen verschilt per individu en is ook afhankelijk van de ingenomen dosis.